Een groot deel van de Hortus is toegankelijk voor mensen die minder goed ter been zijn of die gebruik maken van een rolstoel of scootmobiel. Het Tropisch Terras, de loopbrug in de Tropische Kassen, de Victoriakas en de loopbrug in de Wintertuin zijn niet bereikbaar voor rolstoelgebruikers. Er is geen invalidenparkeerplaats direct bij de Hortus. Er zijn drie invalidenparkeerplaatsen bij het Lipsiusgebouw (Cleveringaplaats 1) en een vóór het Rijksmuseum van Oudheden (Rapenburg 28).